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摘要 : 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的科研人員熟練掌握了分子生物學(xué)的各種試驗(yàn)技術(shù)，并研制成套試劑盒，使基因克隆表達(dá)變得越來(lái)越容易。但分子生物學(xué)的上游工作往往并非是zui終目的，分子克隆與表達(dá)的關(guān)鍵是要拿到純的表達(dá)產(chǎn)物，以研究其生物學(xué)作用，或者大量生產(chǎn)出可用于疾病治療的生物制品。相對(duì)與上游工作來(lái)說(shuō)，分子克隆的下游工作顯得更難，蛋白純化工作非常復(fù)雜。
蛋白質(zhì)純化的方法選擇
隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的科研人員熟練掌握了分子生物學(xué)的各種試驗(yàn)技術(shù)，并研制成套試劑盒，使基因克隆表達(dá)變得越來(lái)越容易。但分子生物學(xué)的上游工作往往并非是zui終目的，分子克隆與表達(dá)的關(guān)鍵是要拿到純的表達(dá)產(chǎn)物，以研究其生物學(xué)作用，或者大量生產(chǎn)出可用于疾病治療的生物制品。相對(duì)與上游工作來(lái)說(shuō)，分子克隆的下游工作顯得更難，蛋白純化工作非常復(fù)雜，除了要保證純度外，蛋白產(chǎn)品還必須保持其生物學(xué)活性。純化工藝必須能夠每次都能產(chǎn)生相同數(shù)量和質(zhì)量的蛋白，重復(fù)性良好。這就要求應(yīng)用適應(yīng)性非常強(qiáng)的方法而不是用能得到純蛋白的方法去純化蛋白。在實(shí)驗(yàn)室條件下的好方法卻可能在大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用中失敗，因?yàn)楹笳咭笠?guī)?；?，且在每日的應(yīng)用中要有很好的重復(fù)性。本文綜述了蛋白質(zhì)純化的基本原則和各種蛋白純化技術(shù)的原理、優(yōu)點(diǎn)及局限性，以期對(duì)蛋白純化的方法選擇及整體方案的制定提供一定的指導(dǎo)。
1 蛋白純化的一般原則
蛋白純化要利用不同蛋白間內(nèi)在的相似性與差異，利用各種蛋白間的相似性來(lái)除去非蛋白物質(zhì)的污染，而利用各蛋白質(zhì)的差異將目的蛋白從其他蛋白中純化出來(lái)。每種蛋白間的大小、形狀、電荷、疏水性、溶解度和生物學(xué)活性都會(huì)有差異，利用這些差異可將蛋白從混合物如大腸桿菌裂解物中提取出來(lái)得到重組蛋白。蛋白的純化大致分為粗分離階段和精細(xì)純化階段二個(gè)階段。粗分離階段主要將目的蛋白和其他細(xì)胞成分如DNA、RNA等分開(kāi)，由于此時(shí)樣本體積大、成分雜，要求所用的樹(shù)脂高容量、高流速，顆粒大、粒徑分布寬.并可以迅速將蛋白與污染物分開(kāi)，防止目的蛋白被降解。精細(xì)純化階段則需要更高的分辨率，此階段是要把目的蛋白與那些大小及理化性質(zhì)接近的蛋白區(qū)分開(kāi)來(lái)，要用更小的樹(shù)脂顆粒以提高分辨純化的*步，它可以初步粗提蛋白質(zhì)，去除非蛋白成分。蛋白質(zhì)在硫酸銨沉淀中較穩(wěn)定，可以短期在這種狀態(tài)下保存中間產(chǎn)物，當(dāng)前蛋白質(zhì)純化多采用這種辦法進(jìn)行粗分離翻。在規(guī)?；a(chǎn)上硫酸銨沉淀方法仍存在一些問(wèn)題，硫酸銨對(duì)不銹鋼器具的腐蝕性很強(qiáng)。其他的鹽如硫酸鈉不存在這種問(wèn)題，但其純化效果不如硫酸銨。除了鹽析外蛋白還可以用多聚物如PEG和防凍劑沉淀出來(lái)，PEG是一種惰性物質(zhì)，同硫酸銨一樣對(duì)蛋白有穩(wěn)定效果，在緩慢攪拌下逐漸提高冷的蛋白溶液中的PEG濃度，蛋白沉淀可通過(guò)離心或過(guò)濾獲得，蛋白可在這種狀態(tài)下長(zhǎng)期保存而不損壞。 蛋白沉淀對(duì)蛋白純化來(lái)說(shuō)并不是多么好的方法，因?yàn)樗荒苓_(dá)到幾倍的純化效果，而我們?cè)谶_(dá)到目的前需要上千倍的純化。其好處是可以把蛋白從混雜有蛋白酶和其他有害雜質(zhì)的培養(yǎng)基及細(xì)胞裂解物中解脫出來(lái)。
2 緩沖液的更換
雖然更換緩沖液不能提高蛋白純度，但它卻在蛋白純化方案中起著極其重要的作用。不同的蛋白純化方法需要不同pH及不同離子強(qiáng)度的緩沖液。假如你用硫酸銨將蛋白沉淀出來(lái)，毫無(wú)疑問(wèn)蛋白是處在高鹽環(huán)境中，需要想辦法脫鹽，可用的方法有利用半透膜透析，通過(guò)勤換透析液體去除鹽分，此法尚可，但需幾個(gè)小時(shí)，通常要隔夜，也難以用予大規(guī)模純化中。新型的設(shè)備將透析膜夾在兩個(gè)板中間，板的一側(cè)加緩沖液，另一側(cè)加需脫鹽的蛋白溶液，并在蛋白溶液一側(cè)通過(guò)泵加壓，可以使兩側(cè)溶液在數(shù)小時(shí)內(nèi)達(dá)到平衡，若增加對(duì)蛋白溶液的壓力，還可迫使水分和鹽更多通過(guò)透析膜進(jìn)入透析液達(dá)到對(duì)蛋白濃縮的目的。也有出售的脫鹽柱，柱內(nèi)的填料是小孔徑的顆粒，蛋白分子不能進(jìn)入孔內(nèi)，先于高濃度鹽離子從柱中流出，從而使二者分離。蛋白純化的每一步都會(huì)造成目的蛋白的丟失，緩沖液平衡的步驟尤甚。蛋白會(huì)結(jié)合在任何它能接觸的表面上，剪切力、起泡沫和離子強(qiáng)度的快速變化很容易讓蛋白失活。
3 離子交換色譜
這是在所有的蛋白純化與濃縮方法中zui有效方法。基于蛋白與離子交換樹(shù)脂間的相互電荷作用，通過(guò)選擇不同的緩沖液，同一種蛋白既可以和陰離子交換樹(shù)脂(能結(jié)合帶負(fù)電荷的分子)結(jié)合，也可以和陽(yáng)離子交換樹(shù)脂結(jié)合。樹(shù)脂所用的帶電基團(tuán)有四種：二乙基氨基乙基用于弱的陰離子交換樹(shù)脂;羧甲基用于弱的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂;季銨用于強(qiáng)陰離子交換樹(shù)脂;甲基磺酸酯用于強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。蛋白質(zhì)由氨基酸組成，氨基酸在不同的pH環(huán)境中所帶總電荷不同。大多數(shù)蛋白在生理pH(pH 6—8)下帶負(fù)電荷，需用陰離子交換柱純化，的pH下蛋白會(huì)變性失活.應(yīng)盡量避免。由于在某個(gè)特定的pH下不同的蛋白所帶電荷數(shù)不同，與樹(shù)脂的結(jié)合力也不同，隨著緩沖液中鹽濃度的增加或pH的變化，蛋白按結(jié)合力的強(qiáng)弱被依次洗脫 。在工業(yè)化生產(chǎn)中更多地是改變鹽濃度而不是去改變pH值，因?yàn)榍罢吒菀卓刂?。在實(shí)驗(yàn)室中幾乎總是用鹽濃度梯度去洗脫離子交換柱，利用泵的輔助可以使流入柱的緩沖液中鹽濃度平穩(wěn)地上升，當(dāng)離子強(qiáng)度能夠中和蛋白的電荷時(shí)，蛋白就被從柱上洗脫下來(lái)。但在工業(yè)生產(chǎn)中鹽濃度很難控制，所以常用分步洗脫而不足連續(xù)升高的鹽梯度。與排阻層析相比，離子交換特異性更好，有更多的參數(shù)可以調(diào)整以獲得*的純化效果，樹(shù)脂也比較便宜。值得一提的是，即便是用zui控制的條件，僅用離子交換單一的方法也得不到純的蛋白，還需要其他的純化步驟。
4 親和層析
親和層析基于目的蛋白與固相化的配基特異結(jié)合而滯留，其他雜蛋白會(huì)流過(guò)柱子。本方法存在的問(wèn)題是：?jiǎn)慰狗浅０嘿F，而且也需先純化;單抗與目的蛋白結(jié)合力太強(qiáng).要用苛刻的條件來(lái)洗脫，這會(huì)使目的蛋白失活并破壞單抗;混合物中的其他蛋白如蛋白酶也可能破壞抗體或與它們非特異結(jié)合;某些單抗也會(huì)在純化過(guò)程中從樹(shù)脂上解離下來(lái)混入產(chǎn)物中，也需要從終產(chǎn)物中去除。親和柱通常在純化過(guò)程的后期應(yīng)用，此時(shí)標(biāo)本體積已縮小，大部分的雜質(zhì)已經(jīng)去除。谷胱甘肽S一轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S—transferase，GST)是
zui常用的親和層析純化標(biāo)簽之一，帶有此標(biāo)簽的重組蛋白可用交聯(lián)谷胱甘肽的層析介質(zhì)純化，但本方法有以下缺點(diǎn)：首先，蛋白上的GST必須能合適地折疊，形成與谷胱甘肽結(jié)合的空間結(jié)構(gòu)才能用此方法純化;其次，GST標(biāo)簽多達(dá)220個(gè)氨基酸，如此大的標(biāo)簽可能會(huì)影響表達(dá)蛋白的可溶性，使形成包涵體，這會(huì)破壞蛋白的天然結(jié)構(gòu)，難于進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，有時(shí)即便純化后再酶切去除GST標(biāo)簽也不一定能解決問(wèn)題。另一種可應(yīng)用的親和純化標(biāo)簽是6組氨酸標(biāo)簽，組氨酸的咪唑側(cè)鏈可親和結(jié)合鎳、鋅和鈷等金屬離子，在中性和弱堿性條件下帶組氨酸標(biāo)簽的目的蛋白與鎳柱結(jié)合，在低pH下用咪唑競(jìng)爭(zhēng)洗脫。組氨酸標(biāo)簽與GST相比有許多優(yōu)點(diǎn)，首先，由于只有6個(gè)氨基酸，分子量很小，一般需要酶切去除：其次，可以在變性條件下純化蛋白，在高濃度的尿素和胍中仍能保持結(jié)合力;另外6組氨酸標(biāo)簽無(wú)免疫原性，重組蛋白可直接用來(lái)注射動(dòng)物，也不影響免疫學(xué)分析 。雖然有這么多的優(yōu)點(diǎn)，但此標(biāo)簽仍有不足，如目的蛋白易形成包涵體、難以溶解、穩(wěn)定性差及錯(cuò)誤折疊等。鎳柱純化時(shí)金屬鎳離子容易脫落漏出混入蛋白溶液，不但會(huì)通過(guò)氧化破壞目的蛋白的氨基酸側(cè)鏈，而且柱子也會(huì)非特異吸附蛋白質(zhì)，影響純化效果。若目的蛋白可與某種碳水化合物特異結(jié)合，或者需要某種特殊的輔因子，可將該碳水化合物或輔因子固相化制成親和柱，結(jié)合后目的蛋白可用高濃度的碳水化合物或輔因子洗脫。
5 疏水作用層析
疏水作用層析蛋白是由疏水性和親水性氨基酸組成的。疏水性氨基酸位于蛋白空間結(jié)構(gòu)的中心部位，遠(yuǎn)離表面的水分子。親水性氨基酸殘基則位于蛋白表面。由于親水性氨基酸吸引了許多的水分子，所以通常情況下整個(gè)蛋白分子被水分子包圍著，疏水性氨基酸不會(huì)暴露在外。在高鹽濃度的環(huán)境中蛋白的疏水性區(qū)域則會(huì)暴露并與疏水性介質(zhì)表面的疏水性配基結(jié)合。不同的蛋白疏水性不同，與疏水作用力大小也不同，通過(guò)逐漸降低緩沖液中鹽濃度沖洗柱子，在鹽濃度很低時(shí)，蛋白恢復(fù)自然狀態(tài)，疏水作用力減弱被洗脫出來(lái)。 疏水性樹(shù)脂的選擇性是由疏水性配基的結(jié)構(gòu)決定的，常用的直鏈配體為烷基配體(alkyl ligands)和芳基配體(arylligands)，鏈越長(zhǎng)結(jié)合蛋白的能力也越強(qiáng)。理想樹(shù)脂種類的選擇應(yīng)根據(jù)目的蛋白的化學(xué)性質(zhì)而定，不能選擇結(jié)合力太強(qiáng)的樹(shù)脂，結(jié)合力太強(qiáng)的樹(shù)脂會(huì)很難洗脫，所以開(kāi)始時(shí)應(yīng)選用中等結(jié)合力的苯基樹(shù)脂探討條件。為了使選擇合適的介質(zhì)更容易，Amersham Biosciences推出了疏水作用樹(shù)脂選擇試劑盒，里面包括5種不同的樹(shù)脂供比較。疏水層析很適合作為離子交換純化的下一個(gè)步驟，因?yàn)槭杷饔脤游鲈诟啕}濃度下上樣，從離子交換得到的產(chǎn)物不需更換緩沖液即可使用。蛋白又在低鹽緩沖液中洗脫，又省去了下一步純化前的更換緩沖液的步驟，既節(jié)約了時(shí)間，又減少了蛋白的丟失。
6 排阻層析
也叫凝膠過(guò)濾或分子篩。排阻層析柱的填充顆粒是多孔的介質(zhì)，柱中圍繞著顆粒所能容納的液體量叫流動(dòng)相，也稱無(wú)效體積。太大的蛋白不能進(jìn)入顆粒的孔內(nèi)，只能存在于無(wú)效體積的溶液中，將會(huì)zui早從柱中洗脫出來(lái)，對(duì)這部分蛋白無(wú)純化效果。由于各種蛋白的分子大小不同，擴(kuò)散進(jìn)入特定大小孔徑顆粒內(nèi)的能力也各異。大的蛋白分子會(huì)被先洗脫出來(lái)，分子越小，洗脫出來(lái)的越晚。為得到*的純化效果，應(yīng)將孔徑大小選在目的蛋白能在無(wú)效體積和總柱床體積的中點(diǎn)附近洗脫。排阻層析有其他方法所不具備的優(yōu)點(diǎn)，首先所能純化的蛋白分子量范圍寬，Tosoh Biosep公司的聚合物樹(shù)脂，排阻極限可達(dá)20o000kD;其次，樹(shù)脂微孔的形狀適合分離球形的蛋白質(zhì)，純化過(guò)程中也不需要能引起蛋白變性的有機(jī)溶劑。應(yīng)該注意的是某些蛋白不適合用凝膠過(guò)濾純化，因?yàn)楸炯夹g(shù)所用樹(shù)脂有輕度的親水性，電荷密度較高的蛋白容易吸附在上面。排阻層析從不用于純化過(guò)程的早期，因?yàn)檫@種方法要求標(biāo)本高度濃縮，上樣量只能在柱體積的1%--4%之間，柱子要細(xì)而長(zhǎng)才能得到好的分離效果，樹(shù)脂本身也比較昂貴，規(guī)?；墓I(yè)生產(chǎn)中不太適用。
7 電泳
丙烯酰胺凝膠電泳通常用來(lái)查看蛋白混合物樣品的復(fù)雜程度和監(jiān)測(cè)純化效果。這種方法分離效果*，可惜很難在不喪失精度情況下放大到制備規(guī)模，因?yàn)殡S著膠厚度的增加，電泳時(shí)的熱效應(yīng)會(huì)嚴(yán)重干擾蛋白的泳動(dòng)。在基礎(chǔ)研究中，有時(shí)僅需要少量的純蛋白進(jìn)行研究，如蛋白質(zhì)測(cè)序等，此時(shí)電泳純化不失為一種簡(jiǎn)便快速的好方法。丙烯酰胺凝膠電泳也是蛋白純化過(guò)程中重要的分析工具，可以檢測(cè)目的蛋白是在哪個(gè)梯度的離子交換柱鹽洗脫液中;可用來(lái)判定近年來(lái)隨著各學(xué)科的迅猛發(fā)展，對(duì)蛋白純化技術(shù)的需求不斷增長(zhǎng)，已有的純化方法被日益改進(jìn)，新型的純化方法也相繼涌現(xiàn)。羥磷灰石是磷酸鈣的結(jié)晶，由于其理化性質(zhì)不夠穩(wěn)定，結(jié)合能力差，很難用于層析。
進(jìn)來(lái)Bio—Rad公司對(duì)其進(jìn)行了改進(jìn)，提高了鈣和磷的比例，使形成球形、多孔、性質(zhì)穩(wěn)定的陶瓷羥磷灰石顆粒，其帶正電的鈣離子和負(fù)電性的磷酸根離子可分別與蛋白的羧基及氨基結(jié)合。通過(guò)調(diào)整緩沖液的pH值，酸性及堿性氨基酸可選擇性地與此樹(shù)脂結(jié)合，改變緩沖液的鹽濃度可將蛋白洗脫分離。資料顯示，使用這種方法能使兩種等電點(diǎn)、分子量和疏水性相同的蛋白很好分離。親和純化方面，Sigma發(fā)展了利用FLAG標(biāo)簽的純化方法，F(xiàn)LA G序列為N—AspTyrLysAspAspAspAsp-Lys-C，分子量小且親水性，與其融合表達(dá)的蛋白不易形成包涵體，活性也不受影響，用該公司抗FLA G抗體親和樹(shù)脂即可純化目的蛋白。其他新型標(biāo)簽及相應(yīng)純化系統(tǒng)還有CBP fCalmodulin—binding peptide，CBP)、Promega公司的BCCP(Biofin carboxylcarrierprotein.BCCP】標(biāo)簽和親和素一生物素純化系統(tǒng)、麥芽糖結(jié)合蛋白fMaltose-binding protein，MBP)標(biāo)簽、Biolabs公司的IMPACT—CN系統(tǒng)、Novagen公司的CBD—Tag和，I7一Tag 系統(tǒng)等。相信隨著時(shí)間的推移，會(huì)有更多更好的方法出現(xiàn)，合理充分地應(yīng)用這些方法，對(duì)科研、生物制藥、疫苗、診斷試劑研制等工作都會(huì)有很大幫助。
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