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熒光免疫技術是標記免疫技術中發(fā)展zui早的一種。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。Coons等于1941年采用熒光素進行標記而獲得成功。這種以熒光物質標記抗體而進行抗原定位的技術稱為熒光抗體技術（fluorescentantibodytechnique）。熒光免疫法按反應體系及定量方法不同，還可進一步分做若干種。與放射免疫法相比，熒光免疫法無放射性污染，并且大多操作簡便，便于推廣。國外生產的TDM用試劑盒，有相當一部分即屬于此類，并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動分析儀生產。
　　
由于一般熒光測定中的本底較高等問題，熒光免疫技術用于定量測定有一定困難。近年來發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測定，與酶免疫測定和放射免疫分析一樣，在臨床檢驗中應用。　

有關熒光的基本知識:
一、熒光現象
（一）熒光的產生　　一此化學物質能從外界吸收并儲存能量（如光能、化學能等）而進入激發(fā)態(tài)，當其從激發(fā)態(tài)再回復到基態(tài)時，過剩的能量可以電磁輻射的 形式放射（即發(fā)光）。　　熒光發(fā)射的特點是：可產生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光；而一旦停止供能，發(fā)光（熒光）現象也隨之在瞬間內消失。　　可以引起發(fā)熒光的能量種類很多，由光激發(fā)所引起的熒光稱為致熒光。由化學應所引起的稱為化學熒光，由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光。熒光免疫技術一般應用致熒光物質進行標記?！　?/span>

（二）熒光效率　　熒光分子不會將全部吸收的光能都轉變成熒光，總或多或少地以其他形式釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉變成熒光的百分率，與發(fā)射熒光光量子的數值成正比?！　晒庑剩桨l(fā)射熒光的光量分子數（熒光強度）／吸收光的光量子數（激發(fā)光強度）　　發(fā)射熒光的光量子數亦即熒光強度，除受激發(fā)光強度影響外，也與激發(fā)光的波長有關。各個熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜），即在某一特定波長處有zui大吸收峰和zui大發(fā)射峰。選擇激發(fā)光波長量接近于熒光分子的zui大吸收峰波長，且測定光波量接近于zui大發(fā)射光波峰時，得到的熒光強度也zui大。

（三）熒光的猝滅　　熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時間的照射后會減弱甚至猝滅，這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復到基態(tài)，所吸收的能量無法以熒光的形式發(fā)射。一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑，以消除不需用的熒光。因此熒光物質的保存應注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。在熒光抗體技術中常用一些非熒的色素物質如亞甲藍、堿性復紅。伊文思藍或低濃度的過錳酸鉀、碘溶液等對標本進行得當復染，以減弱非特異性熒光本質，使特異熒光更突出顯示。　　

二、熒光物質　　
（一）熒光色素　　許多物質都可產生熒光現象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產生明顯的熒光并能作為染料使用的有機化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。
常用的熒光色素有：　　
1．異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）為黃色或橙黃色結晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，zui大吸收光波長為490495nm，zui大發(fā)射光波長520530nm，呈現明亮的黃綠色熒光，結構式如下：　　有兩種同分異結構，其中異構體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質結合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應用zui廣泛的熒光素。
其主要優(yōu)點是：①人眼對黃綠色較為敏感，②通常切片標本中的綠色熒光少于紅色?！?/span>
　
2．四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質穩(wěn)定，可長期保存。結構式如下：zui大吸收光波長為570nm，zui大發(fā)射光波長為595～600nm，呈橘紅色熒光　

3．四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）結構式如下：　　zui大吸引光波長為550nm，zui大發(fā)射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標記或對比染色。其異硫氰基可與蛋白質結合，但熒光效率較低?！　?/span>

（二）其他熒光物質　　
1．酶作用后產生熒光的物質某些化合物本身無熒光效應，一旦經酶作用便形成具有強熒光的物質。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基苯乙酸等?！　?/span>
2．鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3+）、鋱（Tb3+）、鈰（Ce3+）等的螯合物經激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3+應用zui廣。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時間長，用于分辨熒光免疫測定。免疫學基本常識：抗原、抗體及單克隆抗體　*，人或動物可以依靠自身的能力抵御某些疾病的侵襲，也有一些疾病可以通過機體自身調控而自愈，這是因為機體內部存在一個免疫系統(tǒng)。免疫系統(tǒng)是由中樞免疫組織（骨髓、胸腺、消化系統(tǒng)免疫組織）和外周淋巴組織（淋巴結和脾臟）的免疫活性細胞（B淋巴細胞、漿細胞），以及由它們產生的多種淋巴因子和抗體所組成。免疫系統(tǒng)對外來物質產生一系列反應的過程稱為免疫，而這種反應本身則稱為免疫應答。能夠在機體中引起特異性免疫應答的物質稱為抗原，免疫應答的結果則是刺激機體產生與抗原相對應的特異性抗體和引起細胞免疫。由于免疫應答同時取決于機體，而不僅是進入機體的物質，所以抗原的定義是相對的。由此，按照免疫應答的效果可以將抗原分為*抗原和半抗原：*抗原是指能夠直接誘導機體產生特異性免疫應答的一類物質。*抗原的分子量都大于5000，其化學成分多為蛋白質或脂多糖，其它如脂蛋白，糖蛋白，多糖體，多肽，核酸等也都是*抗原。半抗原能與抗體特異性結合，但不能激發(fā)機體產生抗體，必須與蛋白質（載體）結合后進入機體，才能產生有效的免疫應答。大分子的半抗原在體外能與對應的抗體結合發(fā)生可見反應（凝集、沉淀），小分子的半抗原能與對應抗體結合而不出現可見反應。此外，抗原還可以按照自身的物質屬性分為可溶性（毒素、異種蛋白）或顆粒性（細菌、細胞）抗原，或按臨床意義分為外源性和內源性抗原?？贵w是在抗原刺激下機體免疫應答的產物。所有抗體都具有與抗原特異性結合的能力?？贵w的化學本質是免疫球蛋白即γ－球蛋白。不過只有當免疫球蛋白針對已知抗原時，才能夠稱這種免疫球蛋白為抗體。免疫球蛋白屬于結構牢固的分子物質，可以經受較大變化的環(huán)境作用，諸如56℃加溫，在室溫下較長時期的貯藏，短期高或低pH處理，甚至與去污劑或尿素接觸后仍保持其抗體活性?？贵w活性是指與抗原特異性結合的能力，即二者之間的特殊親合力。兩者非共價鍵結合，結合的力包括氫鍵，靜電力，范德華力和疏水結合力。抗體抗原之間的反應是可逆的，在適宜的條件下仍可解離而性質不變。機體內約有1億種不同的B淋巴細胞，每個獨立的B淋巴細胞只能接受一種抗原的刺激從而形成分泌一種抗體的能力，因此特異性是免疫應答的*標志。如常識所見，麻疹患者愈后即獲得對麻疹的終生免疫，而這并不形成對天花的免疫?？贵w抗原特異性結合的本質是抗原決定簇與抗體結合簇的專一適配性，抗原決定簇是指抗原分子上專有的化學基因，可以決定其刺激機體所產生抗體的特異性?？乖瓫Q定簇與其相對應的抗體結合簇立體構型*相適應。一個抗原分子可帶有多個不同的決定簇?？乖肿恿坑螅瑳Q定簇數量愈多。決定簇數目代表抗原分子的價?？贵w結合簇是在抗體分子上與對應的抗原決定簇發(fā)生特異性結合的部位，位于Ig分子的抗原結合分段（V段）上，由重鏈和輕鏈的一部分可變區(qū)構成。其特異性由氨基酸排列順序決定，約包括5～15個氨基酸。每個單體免疫球蛋白分子如IgG有2個結合簇，IgA是二聚體，有4個結合簇，IgM是五聚體所以有10個結合簇。(但是，事情并不是的。一種抗體除與相對應的抗原發(fā)生特異性反應外，也有可能與化學結構部分相似的其它抗原發(fā)生反應，這就是通常所說的交*反應。交*反應可能由于兩種抗原有共同的決定簇，或由于兩者的抗原決定簇雖然不*相同，但在立體化學結構上密切相關，導致一種抗原能與另一種抗原的對應抗體結合。)正常情況下，抗體與抗原在機體內結合后，可以被吞噬、排泄而將抗原清除。如果這種抗原屬于外源性致病抗原（細菌、病毒、毒素），可以由此達到殺滅或削弱抗原危害的目的。對于內源性抗原，如已經衰退、損傷或突變的異常細胞，也能被及時排除，實現機體自身的免疫調控。當然，在異常情況下，抗體抗原結合后形成的免疫復合物將損傷組織、細胞，引起花粉過敏一類的變態(tài)反應或免疫性疾病等不良后果。不過長期以來所謂特異性免疫血清抗體，不論是從人還是從動物獲得的，也不論是主動獲得還是被動獲得的，實際上都是有許多種具有不同特性的抗體所組成的混合抗體。這是因為，進入機體的抗原往往帶有若干個抗原決定簇。此外，不同個體對同一抗原決定簇的反應并不相同，即使同一個體不同時間接受抗原刺激后產生的反應也不*一致。由于人們無法將體內已受抗原刺激的各種不同的B淋巴細胞克隆區(qū)分開，即使在體外能將它們分成單細胞，也無法讓其繼續(xù)生長，增殖并分泌抗體。因此，用常規(guī)免疫方法制備的免疫血清抗體只能是數目眾多的單克隆抗體的混合物，現在，一般稱其為多克隆抗體（PcAb）。這種多克隆抗體存在特異性差、效價低、數量有限、動物間個體差異大，難以重復制備等固有缺陷，許多場合下使用時難盡人意。1975年，英國劍橋大學分子生物學研究室的Kohler和Milstein合作發(fā)表了題為“分泌預定特異性抗體的融合細胞的持續(xù)培養(yǎng)"的論文（Nature,256:495,1975）。他們將已適應于體外培養(yǎng)的小鼠骨髓瘤細胞與綿羊紅細胞免疫小鼠脾細胞（B淋巴細胞）進行融合，發(fā)現融合形成的雜交瘤細胞具有雙親細胞的特征：即像骨髓瘤細胞一樣在體外培養(yǎng)中能夠無限地快速增殖，又能持續(xù)地分泌特異性抗體，通過克隆化可使雜交細胞成為單純的細胞系，由此單克隆系就可以獲得結構與各種特性*相同的高純度抗體，即單克隆抗體（McAb）。上述方法創(chuàng)立了一項具有劃時代意義的新技術－利用B淋巴細胞雜交瘤產生單克隆抗體。這一技術的創(chuàng)立和迅速推廣，為所有需要制備和使用抗體的研究領域提供了全新的手段和制劑，促進了生命科學諸學科的發(fā)展。兩位科學家也由于這一杰出貢獻榮獲1984年諾貝爾醫(yī)學和生理學獎。黃曲霉毒素B1是一種二氫呋喃氧雜萘鄰酮的衍生物，分子量為312，屬于半抗原，不能直接誘導機體產生免疫應答。因此我們的工作首先是將黃曲霉毒素B1與載體蛋白連接，合成為*抗原，以后的研究則基本上采用了前述雜交瘤－單克隆抗體技術的經典方法：動物免疫→免疫脾細胞與骨髓瘤細胞融合→細胞篩選→用有限稀釋法分離出可分泌特異性抗體的單個細胞，再經過克隆化培養(yǎng)建立雜交瘤細胞株并制備出大量單克隆抗體，從而在此基礎上zui終建立了黃曲霉毒素B1（AFB1）的免疫檢測方法。

免疫標記法
（一） 熒光免疫法：原理是應用一對單克隆抗體的夾心法。底物用磷酸-4-甲基傘形酮，檢測產物發(fā)出的熒光，熒光強度與Mb濃度呈正比，可在8min內得出結果。結果以Mb每小時釋放的速率表示(△Mb)表示。該法重復性好，線性范圍寬，具有快速、敏感、準確的特點。以雙抗夾心法為例，首先將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體。除去未結合抗體，然后加受檢標本，使其中的蛋白抗原與固相抗體形成抗原抗體復合物。洗滌除去未結合物，接著加入熒光標記的抗體，使之與抗原特異性結合，形成抗體—抗原—抗體復合物。zui后根據熒光強度，即可對蛋白抗原進行定量。　 傳統(tǒng)的熒光免疫法受本底熒光的干擾較大，時間分辨熒光免疫測定法是以具有特長壽命的稀土金屬如銪，作為標記物，加入正常液后激發(fā)測定，能有效去除短壽命本底熒光的干擾。
（二） 放射免疫法放射免疫法是以過量的未標記抗原與放射性物質標記的抗原，競爭性地與抗體結合，形成有放射性的抗原—抗體復合物與無放射性的抗原—抗體復合物，并有過剩的標記抗原與未標記的抗原。然后通過離心沉淀等方法，將抗原—抗體復合物與游離抗原分離，分別測定其放射性強度與標準曲線比較，即可對未標記的待測抗原進行定量。RIA法測定血清蛋白靈敏度高、特異性強，可準確定量到ng／ml水平。但早期的方法操作麻煩，耗時長，且有放射性污染。近年來，隨著單克隆抗體的應用，RIA的靈敏度又有了較大提高，且操作大為簡化，并已有商品試劑盒供應，使用方便。
(三) 　酶聯免疫法(ELISA)ELISA法有競爭法和夾心法兩種。競爭法是基于標準或血清Mb和微孑L板上包被的Mb競爭性地與單克隆抗體相結合的原理而建立，該法的zui低檢測限為10μg／L，線性范圍達1 000ug／L。夾心ELISA法與EIA具有良好的相關性(r＝0.92)。ELISA法具有靈敏度高，特異性強，精密度好，操作簡單，適用于多份標本的檢測，不需特殊儀器設備等優(yōu)點，易于推廣普及。但不適合急診的快速檢測。以雙抗法為例。首先包被抗原，然后加入一抗，使一抗與包被抗原形成抗原—抗體復合物。接著加入酶標二抗，形成抗原—抗體—抗體復合物。zui后加入底物，由酶催化底物生成產物。通過產物的生成量即可對蛋白抗原進行定量。
（四）偶聯生物素—親和素系統(tǒng)的酶免法利用了一個親和素分子可以與4個生物素分子結合的特性，使傳統(tǒng)的靈敏度較高的酶免法的靈敏度又有明顯的放大作用。
（五）時間分辨熒光免疫分析時間分辨熒光免疫分析（Timeresolved Fluoroimmunoassay,TRFIA）是一種非同位素免疫分析技術，它用鑭系元素標記抗原或抗體，根據鑭系元素螯合物的發(fā)光特點，用時間分辨技術測量熒光，同時檢測波長和時間兩個參數進行信號分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度。
(六) 解離增強鑭系元素熒光免疫分析解離增強鑭系元素熒光免疫分析（Dissociation Enhanced Lanthanide FluoroimmunoassayDELFIA）是時間分辨熒光免疫分析中的一種。它用具有雙功能基團結構的螯合劑，使其一端與銪（Eu）連接，另一端與抗體/抗原分子上的自由氨基連接，形成EU標記的抗體/抗原，經過免疫反應之后生成免疫復合物。由于這種復合物在水中的熒光強度非常弱，因此加入一種增強劑，使Eu3+從復合物上解離下來，自由Eu3+同增強劑中的另一種螯合劑螯合形成一種膠態(tài)分子團，這種分子團在紫外光的激發(fā)下能發(fā)出很強的熒光，信號增強了百萬倍。因為這種分析方法使用了解離增強步驟，因此稱為解離增強鑭系元素熒光免疫分析。